工程院食品安全院士團隊

科研成果轉化平臺

一、蠟樣芽孢桿菌檢驗的衛生學(xué)意義

芽胞桿菌科，芽胞桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性大桿菌。
● 在自然界分布廣泛，常存在于土壤、灰塵和污水中，植物和許多食品中常見(jiàn)
● 已從多種食品中分離出該菌，包括肉、乳制品、蔬菜、魚(yú)、醬油、布丁、米飯及各種甜點(diǎn)。
● 1950年首次在挪威明確報告其致病作用

? 引起食物中毒的原因－腸毒素

部分菌株能產(chǎn)生腸毒素，有致嘔吐型和腹瀉型兩類(lèi)。
◆ 腹瀉毒素：大分子量蛋白質(zhì)，引發(fā)腹瀉型綜合癥,能在各種食物中形成；
◆ 嘔吐毒素：小分子量、熱穩定多肽，100℃ 30min不能被破壞，為引起嘔吐型中毒的致病因素，常在米飯中形成。

臨床表現：
◆ 腹瀉型：潛伏期為8h～16h，主要癥狀為水瀉、腹痛、腹痙攣為主，病程約24h。
◆ 嘔吐型：潛伏期為0.5h～5h，癥狀以惡心、嘔吐為主，病程不超過(guò)24h。  

? 蠟樣芽胞桿菌食物中毒特征

● 以夏季（6-10月）為主

● 致病因子為細菌繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的細菌毒素

● 中毒食品含菌量在10的6次方CFU/g(ml)以上

● 引起中毒的原因常為食品食前保存溫度不當，放置時(shí)間較長(cháng)或食品加熱不當

● 美國 炒米飯
● 歐洲 甜點(diǎn)、肉餅、色拉、奶和肉制品
● 中國 米飯、淀粉類(lèi)制品

二、蠟樣芽孢桿菌的生物學(xué)特性

兼性好氧。生長(cháng)溫度范圍20～45℃菌落較大，干燥，灰白色，不透明，圓形，凸起，表面粗糙似磨砂玻璃或融蠟狀，中等擴散。

10℃以下生長(cháng)緩慢或不生長(cháng)。50℃時(shí)不生長(cháng)。   

在100℃下加熱20min可破壞這類(lèi)菌。

三、蠟樣芽孢桿菌的檢驗方法

? 產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗流程

01) 樣品的處理

◆ 稱(chēng)取25 g樣品至盛有225 mL磷酸緩沖液或0.85%生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內，8000 r/min-10000 r/min均質(zhì)1min-2min，或放入盛有225 mL 稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min-2 min，制成1:10樣品勻液。

02) 液體的稀釋

◆ 用1 mL的無(wú)菌吸管或微量移液器吸收1：10樣品勻液1 mL，加到盛有9 mL磷酸鹽緩沖液或0.85%生理鹽水的試管中，充分混勻，制成1：100的樣品勻液。

◆ 按上一步操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液，直至適宜稀釋倍數

03) 樣品的接種

◆ 選擇2-3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），單個(gè)平行實(shí)驗中分別吸取0.3 mL、 0.3 mL、 0.4 mL的樣品勻液加入MYP瓊脂平板，一個(gè)稀釋梯度兩個(gè)平行（共6個(gè)板），然后用無(wú)菌L棒均勻涂布于整個(gè)平板。

04) 分離培養

在通常情況下，涂布之后將平皿靜置10-30min，待樣品勻液吸收后翻轉平板，30℃ ± 1℃培養24h。如果培養物的菌落特征不顯著(zhù)，則繼續培養至48h。

從符合計數要求的毎個(gè)平板中至少挑取5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），劃線(xiàn)接種于營(yíng)養瓊脂平板做純培養，30 ℃±1 ℃培養24 h±2 h。   

蠟樣芽孢桿菌在MYP瓊脂平板上生長(cháng)的典型菌落為直徑2 mm-5 mm，菌落表面粗糙，在深紅色背景下呈現粉紅色或微粉紅色，環(huán)繞產(chǎn)生5 mm，寬的卵磷脂酶沉淀環(huán)。沒(méi)有根狀生長(cháng)特性（蕈狀芽孢桿菌形成根狀生長(cháng)特征）。

酚紅為pH指示劑；發(fā)酵D—甘露醇產(chǎn)酸使菌落顯黃色；卵黃含有卵磷脂，蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生卵磷脂酶，在菌落周?chē)a(chǎn)生沉淀環(huán)；多粘菌素B可抑制雜菌的生長(cháng)。

MYP瓊脂平板劃線(xiàn)接種蠟樣芽孢桿菌	MYP瓊脂平板涂布接種蠟樣芽孢桿菌
MYP瓊脂平板接種蠟樣芽孢桿菌：微粉紅色（表示不利用甘露醇），周?chē)邪咨恋凵恋憝h(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）

蠟樣芽孢顯色培養基

蠟樣芽孢桿菌在蠟樣芽孢顯色培養基平板上生長(cháng)的典型菌落為直徑2 mm-5 mm，菌落表面粗糙，中心藍綠色，環(huán)繞產(chǎn)生5 mm，寬的卵磷脂酶沉淀環(huán)。

05) 生化鑒定

接種生化鑒定培養基后36±1℃培養18-24h結果

◆ 生化試驗：溶菌酶耐性、甘露醇、葡萄糖（厭氧）、淀粉水解、硝酸鹽還原、VP試驗、明膠、動(dòng)力、西蒙氏檸檬酸鹽。 

革蘭氏染色

◆ 從每個(gè)平板上挑取5個(gè)典型菌落，如無(wú)典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，分別接種于營(yíng)養瓊脂斜面或平板，30℃ ± 1℃培養24 h,取培養物進(jìn)行革蘭氏染色和證實(shí)試驗。

葡萄糖發(fā)酵試驗

將培養物接種到糖發(fā)酵管中，置于厭氧培養箱中36℃ ± 1℃培養24 h，震蕩后肉湯由紅變黃，表明在厭氧條件下蠟樣芽孢桿菌分解葡萄糖。（也可用液體石蠟形成厭氧環(huán)境）。

硝酸鹽還原實(shí)驗

將培養物接種到硝酸鹽肉湯中，36℃ ± 1℃培養24 h后，加0.25 mL亞硝酸鹽試劑A和0.25 mL亞硝酸鹽試劑 B，在10 min內變?yōu)榧t色為陽(yáng)性反應。

V-P實(shí)驗

將培養物接種到改良V-P培養基中，36℃ ± 1℃培養48h或72h后，2ml培養基中添加1mL 5% α-萘酚乙醇溶液，后加入0.4 mL 40% KOH溶液，靜置15min出現伊紅粉紅色為陽(yáng)性。（注意1：必須在有氧的情況下反應，所以必須充分震搖。2：試劑順序不能顛倒，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性）

酪蛋白分解實(shí)驗

將培養物接種到酪蛋白瓊脂培養基上，36℃ ± 1℃培養48 h，在靠近菌生長(cháng)的地方培養基為透明的，則表明酪氨酸倍分解，陰性則繼續培養至72 h，結果仍為陰性的棄去。

酪蛋白分解試驗	溶血試驗
酪蛋白瓊脂平板	血平板
劃線(xiàn)接種蠟樣芽孢桿菌：菌落周?chē)囵B基出現澄清透明區（表示產(chǎn)生酪蛋白酶）	劃線(xiàn)接種蠟樣芽孢桿菌：淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有完全溶血環(huán)

溶菌酶實(shí)驗

將培養物接種到0.001%溶菌酶營(yíng)養肉湯中，另取培養物接種到普通營(yíng)養肉湯中作對照，36℃ ± 1℃培養24 h，蠟樣芽孢桿菌在本培養基中生長(cháng)，為陽(yáng)性反應。如出現陰性反應繼續培養24 h,結果仍為陰性棄去。

觸酶試驗

在潔凈的平皿內滴加3%過(guò)氧化氫溶液2滴，用牙簽或一次性接種環(huán)挑取新鮮培養物放在平皿內過(guò)氧化氫溶液中，如果半分鐘內發(fā)生氣泡者為陽(yáng)性，不發(fā)生氣泡者為陰性。

根狀實(shí)驗

挑取單個(gè)可疑菌落劃平行直線(xiàn)于經(jīng)室溫干燥1d～2d的營(yíng)養瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養24 h～48h，不能超過(guò)72h。用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標準株作為對照進(jìn)行同步試驗。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長(cháng)的特征。蠟樣芽胞桿菌呈粗糙山谷狀生長(cháng)的特征。

動(dòng)力試驗

用接種針挑取培養物穿刺接種于半固體培養基中，30℃ ± 1℃培養24 h。有動(dòng)力的蠟樣芽孢桿菌沿穿刺線(xiàn)呈擴散生長(cháng)，而蕈狀芽孢桿菌常呈絨毛狀生長(cháng)。

溶血試驗

將疑似菌點(diǎn)種胰酪胨大豆羊血瓊脂平板TSSB，30℃ ± 1℃培養24 h。有動(dòng)力的蠟樣芽孢桿菌會(huì )觀(guān)察到的β-溶血反應。蘇云金芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌呈現弱的溶血現象，而炭疽芽孢桿菌通常為不溶血。

蛋白質(zhì)毒素結晶試驗

06) 計數方法

選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數合計在20 CFU～200CFU之間的平板，計數典型菌落數。如果出現a）~f）現象按公式（1）計算，如果出現g）現象則按公式（2）計算；

a）只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；

b）2 個(gè)連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～200 CFU之間，但只有一個(gè)稀釋度的平板有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

c）所有稀釋度的平板菌落數均小于20 CFU且有典型菌落，應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；

d）某一稀釋度的平板菌落數大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

e）所有稀釋度的平板菌落數均大于200 CFU且有典型菌落，應計數最高稀釋度平板上的典型菌落；

f）所有稀釋度的平板菌落數均不在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200CFU時(shí)，應計數最接近20 CFU或200 CFU的稀釋度平板上的典型菌落；

g）2 個(gè)連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～200 CFU之間且均有典型菌落。

公式一：

T----樣品中金黃色葡萄球菌菌落數； A---某一稀釋度典型菌落的總數； B---某一稀釋度鑒定為陽(yáng)性的菌落數； C---某一稀釋度用于鑒定試驗的菌落數； d---稀釋因子。

公式二：

T --- 樣品中蠟樣芽孢桿菌菌落數; A1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數)典型菌落的總數; B1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數)鑒定為陽(yáng)性的菌落數; C1 --- 第一稀釋度(低稀釋倍數)用于鑒定試驗的菌落數; A2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數)典型菌落的總數; B2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數)鑒定為陽(yáng)性的菌落數; C2 --- 第二稀釋度(高稀釋倍數)用于鑒定試驗的菌落數; 1.1 --- 計算系數; d   --- 稀釋因子(第一稀釋度)。

07) 結果與報告

根據MYP平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數，按4.4中公式（1）、公式（2）計算，報告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌菌數，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。

必要時(shí)報告蠟樣芽胞桿菌生化分型結果。

08) 計算范例

T=65(A)×4(B)  / { 10(d)  × 5 (C) } = 520